ریزازدیادی و بررسی آلکالوئیدهای دارویی گیاه پروانش (catharanthus roseus) در شرایط آزمایشگاهی

گونه گیاهی catharanthus roeus (l.) g. don که عمدتا با نام پروانش ماداگاسکاری شناخته می‏شود گیاهی از خانواده آپوسیناسه می‏باشد که منشا آن مناطق حاره و گرمسیر مانند جنوب هند، اندونزی و ماداگاسکار گزارش شده اما امروزه در سراسر دنیا گسترش یافته است. این گیاه حاوی بیش از 130 نوع آلکالوئید ایندولی ترپنوئیدی (tias) می‏باشد که در میان آن‏ها، دو آلکالوئید دایمری وین‏بلاستین و وین‏کریستین دارای خاصیت ضد تومور بوده و برای درمان بسیاری از سرطان‏ها کاربرد دارند. اما در مقابل تقاضای بالا برای این داروها، مقدار آن ها در گیاه پروانش که تنها منبع آن نیز می باشد بسیار کم است. پیچیدگی و چند مرحله ای بودن مسیر سنتز این دو آلکالوئید و وجود مراکز کایرال چندگانه، تولید اختصاصی برخی پیش ماده های مسیر سنتز آن ها در بافت های تخصص یافته، اثر بخشی کمتر داروهای نیمه سنتزی نسبت به انواع طبیعی و تقاضای بالا برای این دو دارو از مهمترین دلایلی می باشند که توجه محققان را به استفاده از روش های بیوتکنولوژیک و کشت بافت برای افزایش تولید این آلکالوئیدهای حیاتی در گیاه جلب نموده است. در این پژوهش با هدف تعیین بهترین محیط کشت جهت ریزازدیادی و افزایش میزان آلکالوئیدهای ضد سرطان وین بلاستین و وین‏کریستین در گیاه پروانش، 25 ترکیب هورمونی برای تولید کالوس از ریزنمونه برگ، 7 تیمار برای باززایی کالوس‏ها و 30 محیط کشت برای باززایی مستقیم ریزنمونه گره در نظر گرفته شد. سپس آلکالوئیدهای وین‏بلاستین و وین‏کریستین در گیاهان باززا شده به روش ریز استخراج فاز مایع مبتنی بر فیبر توخالی (hf-lpme) استخراج و توسط کروماتوگرافی مایع جفت یونی آنالیز شدند. نتایج نشان داد که باززایی غیر مستقیم ریزنمونه برگ، به‏دلیل باززایی مشکل کالوس ها، احتمال ایجاد جهش و تعداد کم شاخه های تولید شده در این روش نسبت به باززایی مستقیم، روشی مناسب برای ریزازدیادی گیاه پروانش نمی‏باشد. اما استفاده از هورمون bap در محیط کشت حاوی g/l 1 زغال فعال بهترین باززایی مستقیم ریزنمونه گره و تکثیر شاخه را نشان داد. همچنین با افزایش غلظت bap و کاهش غلظت زغال فعال، مقدار آلکالوئیدهای وین‏بلاستین و وین‏کریستین افزایش یافت. بنابراین اگرچه به دلیل وجود ترکیبات فنلی فراوان در گیاه پروانش، استفاده از زغال فعال در محیط کشت برای رشد گیاه الزامی می‏باشد اما به دلیل اثر منفی آن در جذب هورمون‏ها و در نتیجه آن کاهش تکثیر شاخه و تولید آلکالوئیدها، مقدار مصرفی آن در محیط کشت مهم می‏باشد و به‏نظر می‏رسد غلظت g/l 1 زغال فعال مقدار مناسبی برای تهیه محیط کشت های تکثیر شاخه باشد. همچنین انتقال شاخه‏های باززا شده به محیط‏ کشت حاوی naa، سبب افزایش رشد طولی شاخه‏ها شد اما مقدار آلکالوئیدهای دایمری را کاهش داد. این کاهش غلظت در مورد آلکالوئید وین کریستین بیش از آلکالوئید وین بلاستین می‏باشد. در روش استخراج hf-lpme نیز بهترین استخراج آلکالوئیدها در اسید استیک 1/0مولار به عنوان فاز پذیرنده، 5/11:ph برای فاز دهنده و اسید فسفوریک 1/0 مولار برای استخراج عصاره گیاه انجام شد. به دلیل شویش همزمان آلکالوئیدهای دایمری و مونومرهای آن‏ها به‏نظر می‏رسد، استفاده از جفت یون منفی سدیم بوتان سولفونات (c4h9nao3s) در بافر hplc روش مناسب‏تری برای جداسازی آلکالوئیدهای وین‏بلاستین و وین‏کریستین می‏باشد.